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        qPCR不正常曲線分析

        作者:上海捷瑞生物工程有限公司 瀏覽: 發表時間:2020-03-02 12:43:48

        溶解曲線主峰左側有峰

        image.png

        一般考慮是引物二聚體或者短的非特異性擴增,解決手段通常有:

        ◆ 降低引物濃度

        20ul體系正常參考引物用量是10uM濃度 0.4ul

        ◆ 提高退火溫度

        梯度摸索引物退火溫度,一般退火溫度不建議超過63°C

        ◆ 增加模板濃度

        當目的基因表達量極低時,染料法QPCR容易形成引物二聚體產物影響實驗結果,提高模板濃度

        ◆ 重新設計引物

                  

        溶解曲線主峰右側有峰

        image.png

        一般考慮非特異性擴增,去除非特異性擴增的手段有:

        ◆ 提高退火溫度:

        梯度摸索引物退火溫度,一般退火溫度不建議超過63°C

        ◆ 提取的RNA需要去除基因組DNA污染,或者

        ◆ 重新設計引物

                     

        ROX添加不當

        ROX矯正不當可能形成如下熔解曲線圖

        image.png

        解決手段通常有:

        ◆ 一定要清楚機器的ROX矯正信息,加的時候一定要看清標簽,高低要分清

        ◆ ROX要完全融化,混合均勻后再使用

        ◆ 如果是需要矯正的機器型號但是用了不校正的染料,那么可以關閉軟件里面的ROX矯正選項,重新分析數據

                

        高濃度抑制

        image.png

        ◆ 高濃度模板可能存在一些抑制因素,導致擴增產物的減少,稀釋后抑制就降低或者解除了

        ◆ 所以如果出現這樣的情況可以調整模板濃度,Ct滯后我們也可以調整下稀釋倍數,保證足夠多的標準點。

                  

        濃度梯度Ct值異常

        image.png

        ◆ 前面不能出現梯度,原因可能是模板量過高,超出了線性范圍,那么需要去掉前面不能分開的梯度,選擇后面梯度;

        ◆ 后面不能出現梯度,原因可能是模板量低,超出了線性范圍,那么需要去掉后面這些梯度,重新摸索高濃度梯度。

                 

        無擴增曲線

        image.png

        ◆ 機器設定:首先要看下程序的設定方面,如果程序設定錯誤,那么是采集不到熒光信號的,

        (兩步法擴增程序一般將信號采集設置在退火延伸階段;三步法擴增程序應當將信號采集設置在72°延伸階段)

        ◆ 循環數:循環數不夠,一般要設置40個循環,但是循環數太多的話會增加背景信號,降低數據的可信度;

        ◆ 引物降解:可以通過變性PAGE檢測引物是否降解

        ◆ 引物不合適:重新設計引物

        ◆ 模板濃度太低: 減少模板稀釋倍數,如果是未知濃度樣品建議從高濃度開始預實驗;

        ◆ 模板降解:重新制備模板,重復實驗

        ◆ 表達量低:重新反復設計引物,4-5對不可以放棄該基因

                     

        Ct值偏大

        image.png

        ◆ 引物不夠好,擴增效率低,重新設計引物或探針;

        ◆ 優化PCR條件:

        - 改用三步法;

        - 增加鎂離子濃度(如果用mix應該也調整不了這個濃度)

        - PCR各反應成分的降解或加樣量不足

        - 擴增片段太長:建議長度80-200bp

        ◆ 基因表達量低:

        若重新反復設計引物仍不能解決問題,可以放棄該基因或使用其他更為靈敏的檢測方法

                        

        擴增曲線先下降后上升

        image.png

        ◆ 模板濃度太高,基線的終點值大于CT值:

        手動設置減小基線終點值,重新分析數據,(默認的基線范圍一般是3~15個循環,如果遇到擴增在10個循環就起來的那么收到把基線范圍設置到3~5就可以了,或者是CT值前4~5個循環,基線的設置很可能會影響到引物的擴增效率的結果)

                    

        沒有對數增長期

        image.png

        ◆ 探針部分降解導致的,如反復凍融探針;在光下暴露時間過長都可能引起,需要重新更換引物探針

        ◆ PCR反應液中有PCR抑制物,如模板濃度過高,模板中有雜質等

                    

        某一空的熒光信號 特別強

        image.png

        ◆ 試劑制備時沒有充分混勻,各管成分不一樣

        ◆ 如果是探針法的話,可能是探針沒有融化,有一管中的探針量太多

        ◆ 也可能是機器原因,不過這個可能性不大

            

        擴增曲線有向上的尖峰

        image.png

         ◆ 可能是電壓不穩定導致的,也可能是斷電或者突然開蓋導致的。

            

        山峰形擴增曲線

        image.png

        ◆ 反應液蒸發,可能管子沒有蓋好或者管子質量差

            

        標曲標準偏差大于0.5

        image.png

        擴增反應的對數線性期的斜率可用于檢測反應效率。 

        ● 良好的反應效率應在90%-110%之間。 

        ● 擴增效率低于100%,是因為PCR擴增體系中的抑制因素 ,或者RNA有所降解;

        ● 高于100%是因為非特異性擴增或引物二聚體造成。

        解決方案:

        ◆ 試劑使用前需要徹底融化充分混勻,包括Mix、引物和探針

        ◆ 使用精確的移液器,加樣時候要垂直加樣

            

        擴增曲線不光滑

        image.png

        ● 擴增信號太弱

        ● 儀器本身的問題,可能在擴增過程中儀器出現了波動


         

          

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