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        引物合成常見問題解答

        作者:上海捷瑞生物工程有限公司 瀏覽: 發表時間:2020-03-02 14:20:08
        引物合成常見問題解答


        引物是如何合成的

        >>>>>>>

        目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種,無論采用什么機器合成,合成的原理都相同,主要差別在于合成產率的高低,試劑消耗量的不同和單個循環用時的多少。

        (1) 去保護:加入Deblocking脫去堿基上5'- OH的保護基團DMT,獲得游離的5'- OH;

        (2) 耦合:同時加入活化劑和新的堿基,新的堿基5'-OH仍然被DMT保護,3'端被活化與溶液中游離的5'-OH發生耦合反應;

        (3) 封閉:耦合反應中極少數5'- OH沒有參加反應,用封閉試劑終止其后繼續發生反應;

        (4) 氧化:加入氧化劑使其由核苷亞磷酸酯形成更穩定的核苷磷酸酯。

        引物合成后如何處理

        切割與脫保護基:將合成好的寡核苷酸鏈從支持物上化學切割下來。常用新鮮的濃氨水來裂解CPG與初始核苷之間的酯鍵。斷裂下來的寡核苷酸帶有自由的3'羥基。

        純化:根據所合成寡核苷酸的組成和應用來選定純化的方法。常用的純化方法有:C18、OPC、PAGE和HPLC。

        定量:根據寡核苷酸在260nm處的紫外吸收來定量。

        儲存:分裝抽干。

        需要什么級別的引物


        根據實驗需要,確定訂購引物的純度級別。

        應用 引物長度要求 純度級別要求 

        一般PCR擴增 < 60base OPC >60 base PAGE 

        診斷PCR擴增 < 40base OPC, PAGE 

        DNA測序 20base左右 OPC 

        亞克隆,點突變等 根據實驗要求定 OPC PAGE,HPLC 

        基因構建(全基因合成) 根據實驗要求定 OPC PAGE 

        反義核酸 根據實驗要求定 OPC  PAGE 

        修飾引物 根據實驗要求定 PAGE, HPLC 


        如何計算引物的Tm值

        引物設計軟件都可以給出Tm,與引物長度、堿基組成及所使用緩沖夜的離子強度有關。

        長度為25base以下的引物,Tm計算公式為:Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)

        對于更長的寡聚核苷酸,Tm計算公式為:

        Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (GC%) - 600/size

        *公式中,Size =引物長度。



        引物的質量是不是和序列有關?

        >>>>>>>

        四種堿基的性質和各自保護基的性質都有差別。所以合成難度是不一樣的。難度最大的當屬GC重復多的和序列中還有多個連續的G的引物。尤其對于后者,一般公司都做不了20個G以上的引物。實驗證明,如果引物中有超過三個連續G的結構,傳統方法得到的產物質量就會開始下降。而且目前通用的脫鹽、OPC和PAGE方法都無效。


        如何保存引物

        引物合成后,經過一系列處理和純化步驟,旋轉干燥而成無色或白色絮狀干粉。

        干 粉:運輸時常溫運輸,-20℃可以保存一年。

        儲存液:配好后分裝成幾管,避免反復凍融,-20℃可以保存半年。

        工作液:常規使用,4℃保存,也可-20℃保存,但應避免反復凍融。

        修飾熒光引物:需要避光保存,盡快使用為宜。


         

          

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